Virüs İzolasyonu – Antijen Saptanması

• Virüs izolasyonu genellikle 9-10 günlük embriyolu spesifik patojenlerden ari (SPF) yumurtalarda yapılır. Embriyolarda IBV için karakteristik olan klinik bulguların gözlenebilmesi için çok sayıda kör pasajlama gerekli olabilir. İnokülasyondan 5-7 gün sonra embriyolarda oluşan tipik bulgular; embriyonun kıvrılıp cüceleşmesi, kırmızı hemorajik embriyolar ve olasılıkla böbreklerde beyaz ürat birikimleridir.
• Mümkün olduğu durumlarda trakeal sürme preparatlarda (smearlarda) IBV virüsüne bağlanan floresan madde ile konjuge edilmiş antikorlarla yapılan İmmunfloresan Testi.

Virüs İzolasyonu – genom saptanması

• Trakeal örneklerde veya inokülasyon yapılan embriyolu yumurtalarda veya trakeal organ kültürlerinde virüs genomunun saptanması için özel primerlerle RT-PCR kullanılır.
• Genotipin belirlenmesi için kullanılan IBV genomunu tanıyan RFLP

Başa dön

Antikor saptanması

Belirli aralıklarla (klinik bulgular gözlendiğinde ve 2 veya 3 hafta sonrasında) serum örneklerinin test edilmesi serolojik tanının esasını oluşturur. Bu metot ayrıca aşılama sonuçlarının değerlendirilmesi için de kullanılabilir.

Agar Jel Presipitasyon Testi (AGP)

Enfeksiyondan kısa bir süre sonra antikorların presipitasyonunda ani bir artış ve hemen sonrasında bir düşüş gözlenir. Bu test serotip spesifik değildir, fakat yeni oluşan IB enfeksiyonunun saptanması için kullanışlı olabilir. Uygulamasının çabuk ve kolay olması gibi avantajları vardır. Bu test için bir jel agar üzerine iki delik açılır ve bilinen bir IBV antijeni ile şüpheli kanatlının kan serumunun jel üzerinde ilerlemesi sağlanır. Jel üzerinde antijen ve spesifik IBV antikorunun etkileşimi antijenin presipitasyonu ile sonuçlanır, bu olay bize jel üzerinde gözle görülebilen bir hat olarak gözükür.

Başa dön

Virüs Nötralizasyon Testi (VN)

Virüs nötralizasyon testi IBV serotipleri arasında ayrım yapılmasının yanı sıra yeni tiplerin doğrulanması için de kullanılan ve bugüne kadarki testler arasında neredeyse en kesin sonuç verenidir. Testin uygulanması için aranan her bir IB virüsünün kültürü ve her biri içinde monospesik antiserum gereklidir. Bu spesifik antiserumlar serotiplerin tam olarak saptanması isteniliyorsa çok önemlidir. Her biri kullanılacak IBV serotipinin bir grup SPF tavuğa intranazal inokulasyonu ile hazırlanır. 3-4 hafta sonra bu hayvanlardan kan örnekleri toplanır ve bu kanlardan elde edilen serumlar inoküle edilen IB virüsünün serotipine spesifik olan antikorları içerirler.

Laboratuarlarda yapılan testlerde embriyolu tavuk yumurtaları veya organ kültürleri gibi örnekler, aranan her bir virüs için bütün IBV’lara karşı oluşturulan antiserumlarla test edilir. Bu işlem iki şekilde gerçekleştirilebilir; her bir antiserumun sabit bir dilüsyonunun virüsün farklı dilüsyonları ile test edilmesi veya (daha kesin olarak) her bir virüsün bilinen miktarının bir dizi antiserum dilüsyonu ile test edilmesi. Bu yolla her bir homolog (aynı) IBV serotipine karşı olduğu kadar her bir heterolog (farklı) IBV serotipine karşı gerekli her IB virüsünün titresini gösteren aşağıdaki gibi bir Tablo oluşturmak mümkündür. Titre yükseldikçe IBV’leri arasındaki ilişki de artar. Bu yöntemle sahada izole edilen bir virüsün “yeni” olup olmadığı veya bilinen bir IBV serotipi ile ilişkili olup olmadığını söylemek mümkündür.

Tablo: IB virüsleri (aşı ve saha suşları) arasındaki serolojik ilişkiler.

Bu antiserumlara karşı her bir virüs suşunun 100 CD₅₀ ‘si kullanılarak elde edilen karşılıklı nötralizasyon titreleri

Virüs

Köken aldığı ülke

Ma5

4/91

D207

D1466

Ark.

TM86

FB3

A1121

890

57/96

62/96

Ma5

–

560a

–b

–

–

–

–

–

–

–

–

25

4/91

Ingiltere

–

800

–

–

–

–

–

–

–

–

–

D207

Hollanda

–

–

340

–

–

–

–

NDC

–

ND

ND

D1466

Hollanda

–

–

–

100

–

–

–

ND

–

ND

ND

Arkansas

Amerika

–

–

–

–

160

–

–

ND

–

ND

ND

TM 86

Japonya

–

–

–

–

–

560

25

ND

ND

ND

ND

FB3

Japonya

–

38

–

–

–

–

1000

ND

ND

ND

ND

A1121

Tayvan

–

–

–

–

–

–

–

1000

–

–

–

890/80

G. Afrika

–

–

–

–

–

ND

ND

ND

490

–

ND

57/96

Brezilya

–

–

–

–

–

ND

ND

ND

ND

110

ND

62/96

Brezilya

–

–

–

–

–

ND

ND

ND

ND

–

110

(Cook et al, 1999)

Başa dön

Hemaglütinasyon İnhibisyon Testi (HI)

IBV spontan olarak tavuk eritrositlerini aglütüne edemez, bunun için nöraminidaz enzimi ile işlenmesi gereklidir. Test VN testinin olası alternatifi olduğu gibi çok daha basit ve hızlıdır. HI testi deneyimli personel tarafından kontrollü laboratuar koşulları altında yapılırsa serotip spesifik olabilir. Bunun nedeni tavuklar birden fazla IB serotipine maruz kaldıysa VN testine oranla bu teste IB serotipleri arasında daha yüksek oranda çapraz reaksiyonlar oluşmasıdır.

Başa dön

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

Serumdaki 96-kuyucuklu plastik pleytin tabanına yerleştirilen spesifik antikorlar virüse bağlanır. Bu kompleks enzim ile işaretli, anti-y-globulini tarafından saptanır. Bir enzim substratı eklendikten sonra oluşan renklenme ölçülür. Bu test serotip spesifik değildir, fakat kümesin örneğin aşılara karşı yeterli antikor cevap oluşturup oluşturmadığının doğrulanması için kullanışlıdır. Ticari kitleri bulunmaktadır.

Başa dön